Лекция №10. Биологические эффекты, создаваемые нанообъектами

10.1 Состояние работ по исследованию биологических эффектов

Те же свойства, которые делают НО столь привлекательными для широкого внедрения в промышленность и человеческий быт, делают их при определённом стечении обстоятельств потенциально опасными для человека и природы. Наномедицина и нанотехнология вообще являются новыми областями, и существует немного экспериментальных данных о неблагоприятных эффектах, вызванных использованием НО. Нехватка знаний о том, как наночастицы будут встраиваться в биохимические процессы в человеческом теле, вызывает особое беспокойство.

Решение проблем нанобезопасности и нанотоксикологии — общая задача, и её возрастающую значимость характеризует создание в 2006 г. Специального международного журнала Nanotoxicology. Работы в области исследования риска нанотехнологий в настоящее время интенсивно проводятся в США (Национальный институт здоровья США, NIH; Агентство по охране окружающей среды, EPA; Национальный институт рака NCI, и др.) [36-38], в Евросоюзе [39] и других странах, в том числе при участии международных организаций [46-138].

Подробно

• изучаются пути миграции НО в человеческом теле;

• оцениваются времена выведения НО из организма;

• воздействия и соответствующие им эффекты для отдельных клеток, органов, тканей;

• поступление в кровеносную систему через кожу и дыхательнын пути;

• и непредвиденные реакции in vivo;

Ведутся интенсивные работы по развитию стандартов для НО, в том числе и в области медицины. Выпущенные US EPA , EU SCENIHR и NRG ( Nanotechnology Risk Governance ) [36-39,120,121,126], а также Международным Советом руководства рисками (International Risk Governance Council) [46] в 2006-2007 гг. отчеты подчеркивают нехватку экспериментальных данных относительно потенциальных рисков, связанных с наномедициной и нанотехнологией, для человеческого здоровья и экологии. До сих пор проводились исследования только на животных, да и то основной задачей подобных исследований всегда была лишь демонстрация принципов работы НО или какой-либо нанотехнологии.

Очевидно, что тесты для НО и соответствующих НТ должны быть всесторонними. Если тесты на токсичность проводить только на здоровых организмах, неважно, будут ли это эксперименты с животными или клинические исследования, то можно не зарегистрировать неблагоприятные эффекты, которые могут проявляться только у чувствительных групп населения. Кроме очевидных потенциальных рисков для пациентов, есть другие токсикологические риски, связанные с наномедициной.

Существуют еще и проблемы по утилизации наноотходов и экологическому загрязнению от изготовления наномедицинских устройств и материалов. Ещё большее беспокойство вызывают немедицинские применения наночастиц. В общем виде концепция оценки биотоксичности производимых и разрабатываемых НО выглядит так (таблица 6).

Таблица

Схема анализа биотоксичности НЧ

10.2 Результаты экспериментов по выявлению биологических эффектов

Проблема нанотоксичности оказывается ещё более острой из-за того, что токсичность НО не есть простое преобразование уже известной токсикологии к наномасштабам. НЧ демонстрируют отличающиеся от частиц такого же химического состава, но другого размера, физико-химические и, следовательно, токсикологические свойства, причем эти свойства существенно зависят не только от размера НЧ, не только от адгезивных, каталитических, электрических свойств НЧ, но и от их чисто геометрических характеристик (рисунок 12) [60,66-68,76-79,86-89,100-102].

контроль угольная пыль наноуглерод окись титана НЧ окиси титана

Рисунок 12. Сравнение токсического эффекта (воспаление) обычных и НЧ для крыс. В качестве контроля использовалась соль.

Если первоначально, в начале этого десятилетия, токсичные свойства НЧ, нетоксичных по своей химической природе, подвергались сомнению [26,92], то к настоящему времени сомнений в наличии отрицательного эффекта фуллеренов и нанотрубок на жизнедеятельность подопытных мышей и крыс нет [29-42, 51-91]. Наиболее полно динамику развития токсикологических исследований НЧ и НО демонстрирует таблица 7 и рисунок 13.

Таблица 7

Типичные эксперименты по выявлению биологических эффектов, вызываемых НО, за последние 3 года, и их краткая критика

б)

Анализ имеющегося экспериментального материала о биологических эффектах НЧ и НО позволяет сделать следующие выводы:

• токсичность зависит от концентрации НЧ и площади их поверхности, а не от массы/объема;

• токсичность зависит от физико-химической формы НЧ;

• токсичность НЧ зависит от НС, в которую входит НЧ;

• токсичность НЧ выше, чем токсичность микрочастиц такого же размера;

• НЧ могут быть токсичными и для животных, и для растений;

• отсутствуют данные по воздействию НЧ и НО на человека;

• отсутствуют данные по воздействию НЧ и НО на экосистемы как целое, или на популяции как части экосистем.

Необходимо отметить, что эксперименты по воздействию НО на живые организмы и биоматериалы проводились лишь с незначительным набором НО и лишь с некоторыми животными (дафнии, окуни, мыши, крысы) и растениями (кукуруза, соя, капуста, морковь). В экспериментах изучалось лишь разовое воздействие НЧ, затрагивающее лишь незначительную часть жизненного цикла. Хроническое воздействие и последствия разового воздействия на весь жизненный цикл небольших концентраций НЧ пока не исследованы.

Наиболее изученными из НО (если вообще можно говорить о какой-либо «изученности» в условиях недостатка экспериментальных данных!) являются фуллерены. Предварительные результаты экспериментов на животных показывают, что они склонны накапливаться в клетках печени и мозга и имеют выраженную токсичность для водных животных (ракообразные, рыбы) и млекопитающих (мыши, крысы). Однако некоторые исследователи призывают относиться очень осторожно к подобным результатам, по крайней мере, в отношении водных организмов [92]. Они указывают, что водные растворы фуллерена, в которых образуются устойчивые гидратированные сфероподобные комплексы фуллерена диаметром 3-36 нм являются эффективным антиоксидантом и биостимулятором в отличие от препаратов на основе кристаллического фуллерена с НЧ размером около 60 нм, проявляющих прооксидантные и биоцидные свойства.

С другой стороны, есть основания считать, что фуллерены, связываясь в прочные комплексы с ДНК, способны блокировать процессы, связанные с использованием и репарацией генетического материала клетки (рис. 14).

Степень их токсичности оценивается как средняя между никелем и бенз(а)пиреном [15]. Механизм токсического действия фуллерена приведен на рисунке 15 [87].

Степень повреждения ДНК зависит от концентрации НО и времени, в течение которого они взаимодействуют с клетками. Однако механизм воздействия фуллеренов на генетический материал неясен. Требуются дальнейшие эксперименты, чтобы выяснить, проникают ли НО внутрь клетки, или, садясь на мембраны, запускают механизмы косвенного воздействия на ДНК. (Pacheco S.)

Рисунок 14. Компьютерная модель образования комплексов молекул фуллеренов с ДНК.

Рисунок 15. Механизм токсического воздействия фуллерена на живые организмы. Присутствие фуллерена приводит к образованию свободных радикалов, в свою очередь вызывающих повреждение и разрушение клеточных структур и нарушение функционирования биомолекул. Противоречивость результатов о биологических эффектах НЧ только подчеркивает недостаточность фактического материала и отсутствие общепринятых методик постановки подобных экспериментов и обработки полученных результатов.

Наиболее полный обзор исследований нанотоксичности приведен в [60,66]. Эти исследования позволили построить принципиальную схему кинетики НЧ в организме человека и наметить дальнейшие пути экспериментальных исследований (рис. 15 -17).

Рисунок 17. Биокинетика НЧ (схема).

Недостаточно данных о коэффициентах переноса, накопления и выведения НЧ В числе экспериментов по биологическим эффектам иных НО следует отметить исследования биоцидных свойств НЧ металлов, прежде всего серебра. Импульсом к исследованию биоцидных свойств НЧ серебра послужило предположение, что хорошо известные биоцидные свойства металлического серебра могут быть многократно усилены за счет специфических особенностей наночастиц (малые размеры и большая удельная поверхность). Действительно, НЧ серебра, полученные методом биохимического синтеза, обладают высокой биоцидной активностью по отношению к широкому спектру бактерий и вирусов [14,94].

10.3 Проблема определения «дозы» и зависимости «доза-эффект» для НЧ

Как уже отмечалось в предыдущих разделах, одной из существенных проблем в исследовании эффекта нанотоксичности является определение понятия «доза». В настоящее время нет однозначного мнения по этому вопросу, поэтому используется различные подходы к определению «дозы» [56,57,60,65,66,84-86,101-103]:

• «массовый», при котором дозовой характеристикой служит общая масса НЧ в рассматриваемом объеме, массе или объекте;

• «численный» - учитывается общее число НЧ в рассматриваемом объеме, массе или объекте;

• «поверхностный» - используется общая поверхность НЧ в рассматриваемом объеме, массе или объекте.

Наиболее удобным для выявления зависимости «доза-эффект» является «поверхностный» подход, тогда как «массовый» является наименее пригодным, так как не учитывает различие в токсическом эффекте НЧ разного размера (рис. 18).

Проведенные исследования показывают, что в рассмотренных диапазонах «доз» зависимость «доза-эффект» линейная, однако нельзя исключать и наличие других зависимостей в области сверхмалых «доз» (рис. 19).

Рисунок 18. Зависимость «доза-эффект» для НЧ окиси титана для крыс (вверху) и мышей (внизу) для «массовой» концепции дозы (слева) и «поверхностной» концепции дозы (справа). В качестве эффекта рассматривались воспалительные явления в клетках легких.

Рисунок 19. Возможные формы зависимости «доза-эффект» в области малых «доз». Горизонтальная прерывистая линия разделяет область токсичности (сверху) и область благоприятного действия (снизу) НЧ. Пунктирный овал в правом верхнем углу – область проводимых исследований.

Буквами обозначены различные формы зависимости:

L – линейная зависимость (ионизирующая радиация);

T – пороговая зависимость (большинство ядовитых веществ);

S – надлинейная зависимость (химические вещества);

H – сублинейная (большинство лекарственных средств).

10.4 Физические основы биологического воздействия НО

Главные выводы, заставляющие внимательно исследовать физические основы биологического воздействия НО, логично вытекающие из рассмотренных выше результатов немногочисленных экспериментов, следующие:

1) токсичность зависит от концентрации НЧ и площади их поверхности, а не от массы/объема;

2) токсичность НЧ выше, чем токсичность микрочастиц такого же размера;

Именно эти результаты заставляют отказаться от формального переноса уже достаточно изученных токсических свойств веществ известного химического состава на НМ.

Первое, что бросается в глаза – это зависимость токсичности не от массы или объема НЧ, присутствующих в среде, а от их поверхности. Из набора сил, известных классической физики, таким свойствам обладают лишь силы трения. И эти «поверхностные» силы значительно возрастают относительно прочих, «объемных» (гравитационных, электромагнитных…), сил при уменьшении размера объекта. По этой причине следует ожидать ведущую роль диссипативных и адгезивных сил на наноуровне. Возможно, в природе сил взаимодействия нанобоъектов и кроется разгадка их дополнительной, по сравнению с мезо- и микрообъектами такой же химической природы, опасности.

В настоящее время для описания взаимодействия нанообъектов используют различные уровни моделирования, от чисто феноменологического, по своей сути иммитационного, до полуэмпирического на основе моделей классической молекулярной динамики с заданным потенциалом, и формально-алгоритмических, на основе методов вероятностных асинхронных клеточных автоматов в моделях неидеальных газов. Эти модели носят чисто описательный характер и используются скорее для формализации наблюдаемых экспериментальных результатов, чем для предсказаний возможных эффектов на наноуровне, и потому вряд ли способны пролить свет на причину гипертоксичности нанообъектов.

Если рассматривать вещество в наномасштабе, то, по сравнению с известными, «классическими» фазовыми состояниями, следует рассматривать особое фазовое состояние вещества, в котором из-за наноразмеров структурных элементов ведущую роль играют квантовомеханические эффекты. Поэтому и научными гипотезами, потенциально обладающими предсказательной перспективой токсичных эффектов НЧ и НС, в большей степени являются следующие [110-114]:

• квантовомеханические (шредингеровские), в которых система из атомных ядер (ионов) и электронов описывается на основе уравнений Шредингера;

• квантовомеханические модели молекулярной динамики, в которых используются уравнения Шредингера для определения потенциала межъядерных взаимодействий;

• квантовомеханические на основе эффекта Казимира.

Первые два подхода больше подходят для описания взаимодействий электронных наноустройств, ассемблеров и квантовых точек и мало пригодны для описания взаимодействия НО со сложными биологическим молекулами и структурами.

Рассмотрим типичные для таких подходов рассуждения. Как уже отмечалось, поступая в ОС, НЧ вступают во взаимодействие с окружающим их веществом, образуя наносистемы (НС) [113]). Среда неоднородна, и сами НЧ неодинаковы. Состояние НС характеризуется в любой момент времени функциями распределения НЧ и участков среды по параметрам состояния. НС открыта, и потому изменяется из-за наличия потока вещества и энергии из-за её границ. Решение задачи полагает выявление связи между функциями распределения НЧ с функциями распределения среды, параметрами состояния и потоками вещества и энергии для отработки молекулярно-кинетических и квантово-механических гипотез изменения (эволюции) НС.

Наиболее привлекательным для решения проблем гигиенической и экологической безопасности НТ и НО выглядит квантовомеханический подход на основе эффекта Казимира [110,114].

Рисунок 20. Эффект Казимира.

Сила Казимира очень слаба: два зеркала с A=1 см2 на расстоянии d = 1 мкм притягиваются с силой в F=0.1 мкН, однако на наномасштабе давление, создаваемое эффектом Казимира, сравнимо с атмосферным, а поэтому его необходимо принимать в расчет.

Сближение между НО приводит к возрастанию силы Казимира. Это вполне может объяснить возникновение свободных радикалов при воздействии НЧ на живой организм.